西瓜[Citrullus lanatus（Thunb.） Matsum. et Nakai]属葫芦科西瓜属，一年生蔓生藤本植物，是夏季必不可少的水果之一，我国已成为世界上最大的西瓜生产国和消费国。近年来，随着西瓜种植面积的增大，西瓜枯萎病大面积发生，给瓜农造成了巨大的经济损失。

西瓜枯萎病是一种由半知菌亚门镰孢属尖孢镰刀菌西瓜专化型（Fusarium oxysporum f. sp. niveum，以下简称FON）寄生引起的真菌性土传病害。致病菌从植株根部伤口或者根毛顶端的细胞间隙侵入寄主管壁细胞并在其内生长，之后转移到维管束中大量繁殖，分解、破坏细胞结构，导致导管阻塞，水分运输受阻，最终导致植株萎蔫。该病在西瓜整个生长发育期均可发生，瓜田发病较轻时减产20%左右，严重时可减产85%，甚至绝产，已成为限制西瓜产业发展的主要因素之一。

目前，针对西瓜枯萎病的防治方法主要有农业防治、化学防治和生物防治等。

农业防治

农业防治是利用农业生产过程中的各种管理或栽培措施来防治病虫害。西瓜枯萎病农业防治主要是采取嫁接和轮作，但嫁接技术难度大，全部依赖于人工，劳动力成本高，且砧木的类型和嫁接方式会影响果实品质；另外，轮作需要的耕地面积较大，在土地资源有限的情况下难以实现；而培育西瓜抗枯萎病品种，需要的时间长，经济投入大，且选育出的品种一般不能抗所有的生理小种，适用性较窄。

化学防治

化学防治是利用化学杀菌剂来防治病原菌，长期使用易产生抗药性，造成农药残留，易对环境产生污染。

生物防治

生物防治主要是利用对病原菌有拮抗作用的生防菌来降低病菌数量达到防控目的，因其安全有效，目前已成为新的研究热点。

近年来利用生防菌防治西瓜枯萎病的研究取得了较大进展，本文将从西瓜枯萎病生防菌的获得、鉴定、生物防效，存在的问题及展望作简要综述，旨在为西瓜枯萎病生防菌的开发利用提供一定的参考。

 1 生防菌的获得 

 1.1   生防菌的来源 

研究证明，发生西瓜枯萎病的土壤其微生物群落结构会发生变化，具有生防效果的微生物一般定殖在植物根系附近，因此，主流的研究多是从发病瓜田内未发病植株根际土壤中提取、筛选生防菌。殷晓敏等从海南地区的西瓜植株根际土壤中分离得到明显拮抗FON的甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）菌株XG-1。高苇等从天津地区瓜田根际土壤中分离得到182个菌落，其中16株菌株对西瓜枯萎病病菌有拮抗作用。也有部分研究从茄子、棉花茎秆中提取植物内生防菌，或从腐殖土、鸡粪堆肥、蚯蚓堆肥、连作辣椒田土壤、油菜田土壤中提取西瓜枯萎病生防菌。

1.2   生防菌的分离与筛选

从土壤中获得的微生物数量多，种类复杂，需要对其进行分离和筛选。微生物的分离主要有稀释涂布法和平板划线法。

稀释涂布法的目的是将单一菌株从混杂的微生物群体中分离出来，首先将土壤进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的土壤溶液分别涂布在培养基的表面进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个菌落。

平板划线法的目的是纯化菌种，挑取单一菌落划线接种在培养基上，保证同一个菌落是由同一个细胞分裂、繁殖产生的后代。分离纯化后的菌株还需经过进一步的筛选才能利用。生防菌的筛选主要使用平板对峙法。初筛是在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基中央放置5~7 mm的FON菌饼，在其外周等距接种供试菌株，培养一段时间后观察菌丝拮抗情况；复筛则是将初筛得到的拮抗菌经过培养过滤得到无菌发酵液，进行平板对峙试验，也可以使用拮抗菌滤液制成培养基计算抑菌率。平板对峙法产生拮抗作用，可能与生防菌所分泌的蛋白酶、纤维素酶和几丁质酶等酶相关。

王亚娇等采取平板对峙法共选取抑菌带大于4mm的60个拮抗菌，结合盆栽防效测试，得到综合性好的菌株SFJ11。岳菊等通过平板对峙法得到7株对4种病原菌有较强拮抗作用的菌株。也有研究人员利用肉汤琼脂培养基进行平板对峙试验，从海洋海绵共生菌和土壤样品中初步筛选到具有明显拮抗活性的菌株共6株。

 2 生防菌的鉴定 

经过筛选的生防菌，需要进行进一步的鉴定分类，确定其在进化中的地位，以便加以利用。微生物传统的鉴定方法有形态学分类法和生理生化鉴定法。形态学分类法是通过显微镜观察，参考《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌鉴定手册》等专业手册，基于菌种细胞的形态、大小、排列、运动性、特殊构造和染色反应及菌落形态、在培养基中的生长状态等形态指标进行鉴定分类的一种方法；生理生化鉴定法是利用化学反应来测定微生物的代谢产物，生理生化反应常用来鉴别一些在形态和其他方面不易区别的微生物。这2种方法是最基础的鉴定方法，适用于所有微生物。

 曹云娥等参考《常见细菌系统鉴定手册》，以菌株WQ-6单菌落在培养初期边缘整齐，表面有光泽，培养后期边缘呈锯齿状，四周隆起等形态学特征和菌株在淀粉水解、甲基红试验中呈阳性等生理生化试验结果，初步鉴定WQ-6菌株属芽孢杆菌属。王卿参照《伯杰氏细菌鉴定手册》，根据拮抗菌株菌落形态、革兰氏染色、芽孢染色菌株以及11项生化检测，初步判定所筛拮抗菌Jaas ed2为多黏类芽孢杆菌，Jaas ed3为枯草芽孢杆菌。冯翠娥将从砂瓜种植大田土壤中分离筛选得到的拮抗菌进行形态特征观察和生理生化试验，初步判断筛选的菌株XS-4、XS-20-15均属芽孢杆菌属。

传统的鉴定方法是目前最基础、最广泛使用的方法，但是存在一些问题：对人员素质要求较高，需要由专业知识丰富和有长期鉴别经验的人来操作，且传统方法指标多，工作量大，耗时长，鉴定准确性差，一般只能鉴定到属，对于相似菌株容易产生鉴定偏差，因此菌株鉴定需要结合现代分子生物学技术进行。

现代分子生物学技术需要提取菌株的遗传物质，相比传统方法，检测结果更加准确。基因序列分析法是目前最常用的分子生物技术。基因序列分析法主要包括rDNA-ITS、18SrDNA、16SrDNA 3种鉴定方法。

其中rDNA-ITS是基于核糖体RNA（rDNA）基因内转录间隔区（Internal Transcribed Spacer，ITS）的多态性序列分析，因其可以从不太长的核酸序列中获得相对足够的信息来明确生物的分类地位，因而被广泛应用于真菌种属间及部分种内组群水平的系统学研究。通过设计合适的引物，利用PCR技术扩增待测菌株的rDNA-ITS序列，将其测序后，从GENBANK中获取相似序列，使用BLAST和DNAMAN工具对rDNA-ITS序列进行比对分析，构建系统发育树，从而确定真菌菌株的分类。rDNA-ITS包括ITS1和ITS2，当研究亲缘关系较近的种属或群组之间小范围、低水平的序列变化时可以单独分析，若需要对未知真菌进行系统分类学研究或者鉴定种属，则需要分析全长ITS序列。

18SrDNA和16SrDNA分别用于鉴定真核和原核生物。18SrDNA为编码真核生物核糖体小亚基rRNA的DNA序列，对18SrDNA的高变区进行测序对比分析，可用于鉴定真菌在进化中的地位。16SrDNA为编码原核生物核糖体小亚基rRNA的DNA序列，包含9个高变区域，高变区具有属和种的特异性，利用特定引物对细菌16SrDNA某个高变区进行PCR扩增，将其测序后进行对比分析，确定细菌种类。任迁琪等以细菌16SrDNA基因的通用引物通F（27F）和R（1492R）扩增基因，鉴定筛选的放线菌F32菌株为链霉菌属（Streptomyces sp.）。有研究者利用16SrDNA通用引物27F、1492R和gyrB对菌株JK9进行PCR扩增，将得到的基因序列进行测序，并与GENBANK中已有的序列进行BLAST分析，构建系统发育树，发现菌株JK9与芽孢杆菌同一分支支持率为100%，最终鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。

基因系列分析法比传统分类鉴定法更加准确、高效、简便，但鉴定范围受到基因库、数据库的限制。因此，在实际试验过程中，应将传统分类法和现代生物学结合使用，以对微生物进行更准确的鉴定。

 3 生防菌的生物防效 

虽然经筛选鉴定出的菌株具有拮抗效果，但不能确保为最优的实用菌株，在植株根部的定殖能力决定其在实际应用中的生防效果，需要进行进一步的生物防效测定。

测定拮抗菌的生物防效分为室内盆栽试验和大田试验，室内盆栽试验一般以西瓜幼苗作为试验材料，在盆栽基质中注入拮抗菌和FON液测试防治效果，一般试验时间较短，在注入后15d左右进行观察。大田试验一般是室内试验结束后，将较为成熟的拮抗菌制成相应的生物制剂，在连作瓜田中进行测试，一般时间较长，要进行几茬西瓜的比较。陆楚月等在大棚盆栽试验条件下，以2~3片真叶西瓜苗为试验材料，测试绿色木霉对西瓜枯萎病的防控效果，防效为60%；纪明山等将拮抗木霉和拮抗细菌制成不同浓度的生物制剂，分别在室内和田间进行生物防效测定，防效最高可达76.78%和76.79%；王丽丽等用灌根法测试了不同浓度菌株15发酵液对出苗10d的西瓜苗的影响，防效为42.3%。测定生物防效时，除了直接接种拮抗菌外，还可将生防菌与有机肥混合发酵，或制成生物菌剂施用。

生防菌主要是通过降低致病菌的数量来抑制枯萎病的发生，也有些生防菌是通过促进西瓜对营养元素的吸收来提高植株自身抗性，从而达到抑制枯萎病的效果。经试验验证，瓜田接种一定量的丛枝菌根菌能有效改善西瓜植株对氮、磷、硼、锌等矿质营养的吸收，特别是能促进西瓜对土壤中矿质态磷素的吸收。研究还表明，有些生防菌是通过次生代谢物或者提高酶活性来增强植物抵抗力，西瓜植株根部分泌酚酸和有机酸的量会影响枯萎病的发生率，解淀粉芽孢杆菌通过次生代谢产物表面活性素诱导植物产生早期免疫反应，并增强对病原菌的抵抗能力。研究表明，先施加解淀粉芽孢杆菌B6，能诱导西瓜幼苗SOD和POD酶活升高，再施加尖孢镰刀菌，幼苗中SOD和POD酶活会更早、更强烈地表达，激发幼苗抵抗病原菌的潜力。

 4 存在的问题及展望 

生物防治被认为是对环境最友好的防治措施之一，目前国内外已经有很多研究报道，其中有些生防菌已成功应用于生产，例如由水谷欣生物科技有限公司生产的含有枯草芽孢杆菌的西瓜专用菌剂在苗期对西瓜枯萎病的防效高达94.9%，由青岛地恩地生物科技有限公司生产的放线菌菌剂对西瓜枯萎病的防效达到90.9%。利用拮抗微生物防治西瓜枯萎病，不仅可以降低环境污染，还能缓解病原菌的抗性，促进植物生长，增加西瓜产量。

虽然生防菌因对环境安全无污染而成为目前研究的热点，但还是面临着很多问题。例如，同一种生防菌在室内抑制效果比大田更稳定可靠，原因主要是相对于室内环境，大田环境较复杂，易受土壤条件、环境变化、微生物种群数量和种类的影响，使得很多生防菌在大田防治中效果较差或者表现不稳定。此外，生防菌对西瓜枯萎病的拮抗机制并不明确，而且对其本身的风险性评价较少，获得的拮抗菌不能很好地应用。

针对这些问题，研究者可以在今后的工作中着手筛选稳定、高效并具有广谱性的菌株，筛选适合生防菌存活的基质， 提高生防菌在土壤环境中的定殖能力和存活时间。此外，因拮抗菌无法直接接种到大田中，可以在不降低拮抗菌生物活性的前提下将其制成可湿性粉剂、颗粒剂、水分散粒剂和种衣剂，也可接种到生物有机肥中，提高应用效果。研究者还可以结合现代生物技术，加强对西瓜枯萎病的生防菌研究，注重生防菌的田间防效，发掘生防菌的防治潜力，提高生产应用价值，逐渐取代部分化学农药的使用，实现低成本、安全、无污染、增产增质的目标，促进西瓜枯萎病的生物防治取得突破性进展。

信息来自《长江蔬菜》2022年8月下

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